臭氧高浓度高剂量疗法（OHT）改善外周血单核细胞的线粒体生物能量行业资讯世界范围的人口变化和保健的普遍改善已导致人类发病和死亡的主要原因从急性疾病转变为慢性退化性疾病。复杂和慢性疾病涉及的根本机制是代谢功能紊乱，在发达地区是一个日益严重的医疗保健问题，也在逐渐向发展中地区发展。尽管市场上有许多药物，但几乎无法治愈晚期慢性疾病。寻找其他可用于预防和/或作为标准治疗的辅助治疗方案是比较重要的。德国赫尔曼中国

布里吉特·科尼格 Brigitte König

约翰·拉赫蒂尼 Johann Lahodny

转化医学与传播 (2022) 7:17

摘要

背景：

全世界慢性病患者的数量不断增加，这将传统疗法推向了极限。所谓的自体血回输疗法(MAH)已在许多实践中使用多年。尽管存在怀疑，尤其是10个循环的臭氧高浓度高剂量治疗（OHT）在慢性病中显示出了巨大的益处。然而，关于高臭氧浓度的有科学影响的知识仍然很少。目前的调查重点是验证OHT是否与线粒体生物能量学的有益效果相关，线粒体生物能量学可以表示为生物能量健康指数（BHI）。

方法：

我们报告了6名患者在一周内两次接受OHT治疗用于预防目的。外周血单核细胞(PBMC)的BHI是根据细胞线粒体功能测定的参数计算出来的，这可以让我们了解线粒体功能的不同方面：1)基础耗氧量(OCR)；2）ATP关联的OCR和质子泄漏；3）巨大的OCR和储备能力；4）非线粒体OCR。

结果：

结果清楚地表明，在1周内仅应用2次OHT后，PBMC中的生物能量健康指数明显改善。BHI的整体改善主要是基于线粒体储备能力和呼吸作用的显著增加。非线粒体耗氧量增加对BHI值有负面影响，这表明通过OHT激活的抗氧化剂和解毒酶依赖于Nrf-2的激活。

结论：

这些数据首次证明了OHT对线粒体参数的有益影响。因此，本研究的结果表明，由线粒体功能障碍起核心作用的各种慢性和急性疾病中，OHT作为单独或综合与补充药物治疗的支持是一种安全有效的治疗选择。

背景

世界范围的人口变化和保健的普遍改善已导致人类发病和死亡的主要原因从急性疾病转变为慢性退化性疾病。复杂和慢性疾病涉及的根本机制是代谢功能紊乱，是一个日益严重的医疗保健问题。尽管市场上有许多药物，但几乎无法治愈晚期慢性疾病。寻找其他可用于预防和/或作为标准治疗的辅助治疗方案是极其重要的。然而，这些“替代”疗法目前很可能不在常规医学范围内。造成这种情况的原因是，由于其他形式的治疗更容易使用，所以没有采取有希望的方法。例如由于抗生素抗性微生物导致的囊性纤维化中噬菌体疗法的复兴。由于多重耐药微生物导致抗生素治疗的失败越来越多，在囊性纤维化之外，噬菌体治疗的进一步发展也在考虑之中。另一个例子是溶瘤病毒疗法，它基于一个多世纪以来的报道，描述了癌症患者中各种病毒或细菌感染与肿瘤缓解的同时发生。

臭氧疗法已广泛应用于日常临床实践，在过去几年中使用越来越多，并已显示出实质性的好处，涵盖各种急性和慢性疾病，包括椎间盘突出、心血管疾病、神经系统疾病、皮肤病、传染病和疼痛管理。然而，除了众所周知的抗菌和抗氧化能力外，还需要揭示其生理机制。臭氧疗法有多种给药方式。它通常通过直接静脉注射气体（DIV）或一种称为臭氧自体血疗法（MAH）的方法施用。MAH于1954年由韦尔利和斯坦巴特首次描述，从那时起，经过多次修改，它已在全球范围内进行了数百万次，没有副作用并取得了治疗效果，尽管记录不足。简言之，MAH是一种在压力作用下将约200ml血液与臭氧混合后再注入患者体内的程序。50年来，人们一直认为在一个疗程内重复使用臭氧会导致危及生命的溶血。一种更高臭氧剂量和更高臭氧浓度的方法现在被称为“L1”10次-高浓度高剂量臭氧疗法（10个循环OHT）。近期，在一项临床研究中报道，“L1”10个循环OHT是传统疗法的成功补充。

线粒体是众所周知的细胞发电单元。然而，线粒体仅仅作为细胞动力的观点不再准确。除了细胞生物能量学，线粒体研究的主要目标还包括它们与细胞内重要过程的相互作用，包括氧化还原和钙稳态、凋亡和细胞内信号传导。因此，线粒体失调或缺陷被认为是衰老过程和许多常见疾病阶段的关键作用并不为奇，包括糖尿病、动脉粥样硬化、癌症和神经退行性疾病。

2014年，Chacko等人假设，与糖尿病、心血管疾病、肝病、癌症和环境毒素相关的功能失调细胞能量学可以使用一个新参数进行动态评估: 患者群体的生物能量健康指数(BHI)。在这可以证明，这种方法可以作为个性化的基于细胞的测量的基础来量化生物能量健康。BHI是根据细胞线粒体功能测定的参数计算的，该测定可深入了解线粒体功能的不同方面。主要参数为：1）基础耗氧率（OCR）；2）ATP相关OCR和质子泄漏；3）巨大的OCR和储备能力；4）非线粒体OCR。

臭氧疗法对线粒体功能的有益作用可以解释在 OHT 治疗后特别观察到的各种慢性疾病的积极治疗结果。因此，我们将BHI作为一种综合方法，结合糖酵解代谢和氧化磷酸化，为外周血单核细胞生成细胞生物能量谱，以分析其在OHT治疗期间的代谢功能。据我们所知，这是首次分析OHT治疗对线粒体功能影响的研究。

方法

患者

自2015年以来，在拉赫蒂尼博士的妇科和实用医学私人门诊，OHT被用于治疗和预防。6名能连续拜访拉赫蒂尼博士进行预防性OHT治疗的患者被选为这项初步研究的对象。规律性的在OHT治疗之前和期间常规的血液参数采集。在这项初步研究中，在治疗前、初次治疗后立即采集以及第二次治疗一周后常规采集的血液用于分析线粒体功能。

臭氧高浓度高剂量疗法（OHT）

在本案中，L1（10个循环）治疗使用是Hyper Medozon comfort 超豪华型（德国赫尔曼）臭氧治疗仪。在该方法中，将200mL患者的血液从外周静脉抽取到含有7500单位肝素的真空瓶中。臭氧浓度为70μg/mL时产生200 mL的氧-臭氧气体混合物。气体在压力下被泵入瓶中。该压力由额外的氧气维持。血液混合晃动会导致臭氧迅速附着在血浆和血红蛋白上。在瓶内持续加入氧气形成0.9的正压压力使患者的血液能迅速回输回患者的体内。这大大加快了治疗过程。这构成了“一个循环”，可输送14000μg臭氧。再重复该过程9次，输送140000μg臭氧。一个L1（10个循环）持续大约一小时。

血液采集和细胞分离

在进行OHT时，在治疗开始和结束时将血样（1-2管，8.5ml/管）收集到市售的细胞制备管（CPDA；Sarstedt，Nümbrecht，德国）中，并在收集后 24 小时内处理。所有分离程序的设计都是为了防止在分离过程中细胞的激活，例如在室温下进行分离，在制备白细胞时使用RPMI培养基(不含抗生素、不含酚红、不含FBS)。此外，根据标准程序，OptiPrep™(STEMCELL Technologies Germany GmbH, Cologne, Germany)用于外周血单核细胞(PBMC)的制备，每个批次的内毒素水平通常测量在<0.13EU/ml。PBMC的浓度为2.5×10⁵/孔。

细胞生物能量学测量

采用细胞外通量分析仪XFe96 (Seahorse Bioscience, Agilent Technologies)和Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit (Agilent Technologies Germany GmbH & Co. KG, Waldbronn, Germany)测定分离的PBMC的细胞生物能量。在本实验中，研究了细胞耗氧量对连续添加线粒体抑制剂的反应。寡霉素、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素的孔浓度 (2.5×10⁵ PBMC) 为 3/3/5 µM。寡霉素抑制 ATP 合酶（复合物 V），并在基础测量后首先在测定中注射。它影响或减少通过ETC的电子流，导致线粒体呼吸或OCR减少。OCR的降低与细胞ATP的产生有关。羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）是一种解偶联剂，可破坏质子梯度并破坏线粒体膜电位。这是继寡霉素之后的第2次注射。因此，通过ETC的电子流动不受抑制，复合物IV的耗氧量达到MAX。然后，FCCP刺激的OCR可用于计算备用呼吸能力，定义为顶端呼吸和基础呼吸之间的差异。备用呼吸能力是衡量细胞对增加的能量需求或压力下的反应能力的量度。第三次注射是鱼藤酮（复合物I抑制剂）和抗霉素A（复合物III抑制剂）的混合物。这种组合关闭了线粒体呼吸，并能够计算由线粒体外过程驱动的非线粒体呼吸。实验按照制造商(Agilent Technologies)的说明进行，并将复制到6个孔中重复实验，并对每种实验条件取平均值。研究参数为1）基础耗氧率（OCR，pmol/min）；2） ATP连接的OCR和质子泄漏；3）巨大的OCR和储备能力；4）非线粒体OCR。然后，将线粒体应激试验(MST)参数整合为生物能量健康指数(BHI)。此外，从这些数据中，可以根据制造商的说明确定细胞能量表型和个体代谢潜能。

统计分析

分析中报告的数据来自在三个不同时间点从6个不同供体分离的外周血单核细胞（PBMC）。每个PBMC组由3-5个技术重复组成，数据以平均值±SEM表示。采用t-TEST判定差异有统计学意义，p<0.05为显著性。此外，我们使用适当的阿尔法值进行了多重比较方差分析，并计算了校正后的科恩D检验。

结果

研究对象

六名受试者被纳入扩展线粒体功能参数分析。他们的人口统计学和临床特征在方法部分的表1中显示。

生物能量健康指数 (BHI)

我们测定了研究中的6例患者在三个不同时间点的BHI。6例受试者的累计结果Fig.1所示。数据清楚地表明，做过两次10个循环的OHT显著增加了BHI。从线粒体压力测试(MST)中可以获得一些参数，这些参数可以帮助我们了解具体的线粒体功能。在分析的参数中，耗氧率(Fig.2)、储备能力(Fig.3)和非线粒体耗氧率(Fig.4)受到OHT处理的显著影响。BHI分析的所有参数汇总在表2中。

基础OCR（耗氧率）是每个受试者的独立基线，个体之间差异很大。相比之下，氧呼吸（在培养基中注入 FCCP 后）代表了线粒体适应性的一个有价值的参数。该参数的降低与线粒体生物发生的缺陷、mtDNA或呼吸机制的损伤、底物可用性或运输的限制相一致。Figure 2 显示了6例患者在OHT前后PBMC的耗氧率(OCR)(累积数据)。很明显，在10个循环OHT的2次治疗后，OCR（加入FCCP后）显著增加。

储备能力

线粒体压力测试极重要的参数之一是耗氧率（pmol/min）的储备能力。储备容量的值越大，线粒体就越能有效地满足细胞的ATP 需求并处理增加的能量需求和离子或代谢压力。从Fig.3 (6名受试者的累计数据)可以明显看出，经过2次10个循环OHT治疗后，储备能力明显增加。

非线粒体OCR

非线粒体OCR代表活性氧(ROS)生成或其他耗氧过程，包括促炎性酶，如环加氧酶和脂加氧酶。然而，非线粒体耗氧量的增加反应为抗氧化酶和参与解毒的酶的激活。从Fig.4(6位受试者的累计数据)可以明显看出，经过2次10个循环OHT治疗后，耗氧量明显增加。

结论

世界范围内慢性疾病患者数量的增加正将传统疗法推向极限。多年来，所述多个循环自体血治疗已在世界各地的许多实践中取得非常成功的效果。到目前为止，还没有关于OHT促进健康特性的详细解释。研究结果表明，OHT可以调节线粒体功能。这些研究为OHT的进一步发展奠定了基础，OHT是一种安全可靠的方法，用于在精准医学领域，防治多种慢性疾病。

臭氧高浓度高剂量疗法（OHT）改善外周血单核细胞的线粒体生物能量

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